Радиоиммунный анализ

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Радиоиммунологический метод (РИА; син. радиоиммунологический анализ) — основанный на реакции антиген—антитело метод количественного определения биологически активных соединений, обладающих антигенными свойствами, и антигенов микроорганизмов с помощью аналогичных известных антигенов или антител, меченных радиоактивным изотопом. Радиоиммунологический метод позволяет количественно определять в жидкостях организма (сыворотка крови, моча и др.) содержание гормонов и различных антигенов, в т. ч. антигенов микроорганизмов. Основным достоинством Радиоиммунологического метода является его очень высокая чувствительность благодаря использованию изотопной метки антигенов (или антител) и применения сывороток с высоким сродством и специфичностью антител (см.).

Становление и развитие Радиоиммунологического метода связано с работой Ялоу и Берсона (R. S. Yalow, S. A. Berson, I960), предложивших этот метод для определения эндогенного инсулина в плазме крови.

Сущность Р. м. состоит в использовании для определения антигенов (см.) соответствующих иммунных сывороток и введении в систему антиген — антитело антигена, меченного радиоактивным изотопом, напр, йода ( 125 I), в результате чего происходит связывание определяемого (немеченого) и меченого антигена с ограниченным количеством антител. Т. к. меченый антиген добавляется в определенной дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая часть осталась несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. При определенных концентрациях количество меченого антигена, связавшегося с антителами, обратно пропорционально количеству определяемого антигена. Схематически этот процесс можно изобразить следующим образом:

После взаимодействия антигенов с антителами образовавшиеся комплексы антиген—антитело (см. Антиген-антитело реакция) отделяют от свободного меченого антигена. Отделение комплекса антиген—антитело производят различными способами: с помощью электрофореза (см.), гель-фильтрации (см.), фракционного осаждения иммунного комплекса этанолом, сульфатом аммония и др., а также с помощью агрегации иммунных комплексов антиглобулиновой сывороткой или сорбции их на иммобилизованных (прикрепленных к поверхности твердой фазы) антителах. Кроме этого, возможна сорбция свободного меченого антигена с помощью добавленных веществ, напр, талька, целлюлозы, кварца, активированного угля и др. Отделив меченый несвязанный антиген от комплекса антиген— антитело, определяют количество меченого антигена, связавшегося в комплексе но количеству импульсов (с помощью сцинтилляционного счетчика). Снижение количества импульсов в единицу времени в сравнении с соответствующими контролями свидетельствует о присутствии гомологичного меченого антигена, связанного с анти-сывороткой, в результате чего меченый антиген не вступил в реакцию и не определяется в комплексе антиген— антитело.

Иммунную сыворотку против определяемого антигена и меченого антигена предварительно оттитровывают и используют в Р. м. в оптимальном разведении, при к-ром происходит связывание 50% внесенной метки. Для оценки результатов применяют данные (график) зависимости связывания меченого антигена сывороткой в оптимальном разведении от концентрации меченого (стандартного) антигена.

Широко применяются в Р. м. антитела сыворотки против антигена, иммобилизованные (адсорби рованные) на поверхности пластика или химически связанные с поверхностью полимера. В 1966 г. Кетт (K. J. Catt) с группой исследователей, а также Уайд и Порат (L. Wide, J. P. Porath) применили в Р. м. иммобилизацию антител на полимере. Была показана возможность иммобилизации антител на сефадексе и целлюлозе, обработанных бромцианом, а также на различных пластмассах без предварительной обработки активатором. Для проведения реакции в полистироловые пробирки с иммобилизованными на внутренней поверхности антителами вносят определяемый антиген. После инкубации несвязанный антиген удаляют промыванием и вносят меченый антиген, который затем удаляют таким же образом, определяя в дальнейшем долю связанной радиоактивной метки.

Существует разновидность Р. м.— метод двойной системы антител, когда комплекс антиген—антитело обрабатывается антиглобулиновой преципитирующей сывороткой (вторые антитела) с последующим отделением преципитата центрифугированием. Добавление вместе с антиглобулиновой сывороткой нормальной сыворотки крови того же животного. от к-рого получены первые антитела, способствует преципитации комплексов.

Определение антигена с помощью меченых антител получило название иммунорадиометрического метода. В этом случае антиген предварительно фиксируют на твердой фазе, напр, в полистироловых пробирках. При постановке реакции определяемый антиген образует комплекс с мечеными антителами, который остается в растворе, а не прореагировавшие антитела взаимодействуют с антигеном, прикрепленным к твердой фазе. В варианте иммунорадиометрического метода — методе двойного связывания — определяемый антиген образует комплекс с антителами, иммобилизованными на твердой фазе. Затем после удаления свободного антигена промыванием поверхности твердой фазы добавляются меченые антитела, выявляющие комплекс. Радиоактивность комплекса антитело — антиген — антитело — 125 I сравнивается с радиоактивностью контрольных проб, проб, заведомо содержащих и не содержащих антиген.

Высокая чувствительность Радиоиммунологического метода (до пикограмм определяемого вещества) позволила более точно определить концентрацию многих биологически активных соединений. К недостаткам Р. м. относят возможное снижение специфичности за счет посторонних примесей в определяемом образце, напр, некоторых лекарств, и наличие в сыворотке крови перекрестно реагирующих антител. Кроме того, у антигенов и антител, меченных гамма-излучающими изотопами, короткий срок хранения; при работе с ними следует соблюдать особые меры безопасности. В этом отношении существует менее опасный метод, сходный по принципу с Р. м., в к-ром применяются антигены или антитела, меченные ферментом (см. Энзим-иммунологический метод). Широкое внедрение Р. м. затруднено из-за трудности получения стандартных меченых сывороток и антигенов, необходимости соблюдать правила работы с радиоактивными веществами, применять дорогостоящее оборудование (гамма- и бета-счетчики, камеры глубокого охлаждения, компьютеры и др.) и реактивы с высоким требованием к чистоте стандартов, а также высокоспецифические сыворотки.

Библиография: Иммунологические методы исследования в клинике и эксперименте, под ред. А. Я. Лысенко, М., 1978; Иммунологические методы, под ред. X. Фримеля, пер. с нем., М., 1979; Чард Т. Радиоиммунологические методы, пер. с англ., М., 1981, библиогр.; Yаlоw R. S. a. Berson S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man, J. clin. Invest., v. 39, p. 1157, 1960.

Радиоиммунный анализ

61. Иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, иммуноблоттинг. Механизм, компоненты, применение.

Иммуноферментный метод, или анализ (ИФА) ИФА — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. После соединения антигена с ме­ченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связав­шихся молекул антигена и антител.

Твердофазный ИФА — наиболее распростра­ненный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реак­ции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках план­шеток из полистирола (рис. 13.11).

При определении антител в лунки планше­ток с сорбированным антигеном последова­тельно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную фер­ментом, и субстрат (хромоген) для фермента.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшие- ся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный но­ситель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят иско­мый антиген, добавляют иммунную сыворот­ку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента.

Конкурентный вариант ИФА: искомый ан­тиген и меченный ферментом антиген кон­курируют друг с другом за связывание ог­раниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест — искомые антитела и меченые антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены.

ИФА применяют для диагностики вирус­ных, бактериальных и паразитарных болезней в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормо­нов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в ми­норных концентрациях — 10 |(| н-10 12 г/л.

Радиоиммунологический метод, или анализ (РИА)

Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело с примене­нием антигенов или антител, меченных ра­дионуклидом ( 125 J, 14 С, 3 Н, 51 Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и опре­деляют его радиоактивность в соответствую­щем счетчике (бета- или гамма-излучение):

интенсивность излучения прямо пропорцио­нальна количеству связавшихся молекул ан­тигена и антител.

При твердофазном варианте РИА один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Другой вариант метода — конкурентный РИА. ис­комый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за свя­зывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант исполь­зуют для определения количества антигена в исследуемом материале.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, фермен­тов, лекарственных веществ и иммуноглобу­линов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концент­рациях — 10″‘°-н10″ 12 г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность.

Иммуноблоттинг (ИБ) — высокочувстви­тельный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

Антиген выделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг — от англ. blot , пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлоз- ную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами»

антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больно­го + антитело против Ig человека выявляют до­бавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента (рис. 13.12).

ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Радиоиммунный анализ

Этот метод очень широко используется в лабораторной диагностике. С помощью РИА в биологических жидкостях определяют концентрации гормонов, факторов роста, ферментов, аутоантител, маркеров злокачественных новообразований и других веществ (например, лекарственных средств и наркотиков).

I. Принцип. В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Методика РИА проста и включает следующие основные этапы:

А. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.

Б. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.

В. Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их надо отделить от свободного меченного антигена. Наиболее распространены два способа разделения:

1. К реакционной смеси добавляют вещество, повышающее ее плотность, например полиэтиленгликоль.

2. К реакционной смеси добавляют вещество с большой молекулярной массой, которое специфически связывается с антителами в составе иммунных комплексов. Для этого используют вторые антитела либо стафилококковый белок A.

В обоих случаях иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.

Г. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченного антигена.

Разработано множество вариантов РИА . Методика, описанная выше, называется жидкофазным РИА (все реагенты находятся в растворенном состоянии). Существует и твердофазный РИА , в котором антитела иммобилизируются на водонерастворимом носителе, например на полистироле. Особая разновидность метода — иммунорадиометрический анализ, в котором используются меченные антитела, а не меченный антиген.

Принцип РИА распространяется и на другие иммунохимические и неиммунохимические методы анализа. Например, в ИФА вместо радиоактивного изотопа в качестве метки используют ферменты, а в иммунофлюориметрическом анализе — флуоресцирующие вещества. В неиммунохимических методах роль антител выполняют реагенты, специфически связывающие определяемое вещество. Этими реагентами могут быть рецепторы гормонов или связывающие белки плазмы. Так, в радиорецепторном анализе тиреостимулирующих и тиреоблокирующих аутоантител используются очищенные рецепторы ТТГ , а для измерения уровня свободного T4 иногда применяется тироксинсвязывающий глобулин.

Все эти методы анализа называют методами конкурентного связывания.

II. Оценка результатов. В отличие от биологических методов анализа, РИА является количественным иммунохимическим методом и дает возможность точно измерить содержание вещества (антигена) в пробе. Результат РИА зависит только от соотношения компонентов реакции антиген—антитело.

А. Условия надежности результата РИА

1. При разведении пробы измеренная концентрация вещества должна уменьшаться пропорционально степени разведения.

2. Кривая зависимости уровня связывания антител с меченным антигеном от концентрации антигена в пробе должна совпадать с калибровочной кривой.

Если эти условия не выполняются, можно предположить, что на иммунохимическую реакцию влияют факторы, перечисленные ниже. Надо отметить, что правильно интерпретированный результат РИА может иметь диагностическое значение, даже если он не удовлетворяет формальным критериям надежности (например, из-за иммунохимических различий между стандартом и пробой).

Б. Факторы, неспецифически влияющие на иммунохимическую реакцию

Читайте также:  Анализ крови на гомоцистеин

1. pH . Скорость реакции антиген—антитело и стабильность иммунных комплексов обычно не зависят от pH в интервале 7,0—8,5. Как правило, в очень кислой или очень щелочной среде иммунные комплексы диссоциируют, хотя некоторые белки с основными свойствами лучше всего взаимодействуют с антителами при pH 4,0—6,0. Поэтому для каждой системы РИА подбирают оптимальный pH .

2. Состав реакционной смеси также влияет на реакцию антиген—антитело. Энергия взаимодействия антигена с антителом уменьшается при высокой концентрации солей в пробе или в реакционной смеси. Некоторые лекарственные средства (гепарин) и бактерицидные препараты (тиомерсал) подавляют иммунохимическую реакцию. Поэтому для разведения стандартов и проб используют один и тот же буферный раствор и учитывают возможные эффекты компонентов реакционной смеси.

В. Перекрестная иммунореактивность веществ со сходным строением

1. Гетерогенность молекулярных форм пептидных гормонов

а. Пептидные гормоны синтезируются в виде белков-предшественников, которые перед выбросом в кровь подвергаются процессингу. При этом образуется одна или несколько форм гормона, обладающих или не обладающих биологической активностью. Например, при процессинге секретина и ВИП образуется только по одной биологически активной форме каждого гормона. Напротив, гастрин, синтезируемый клетками антрального отдела привратника, поступает в кровь как в виде зрелого гормона, состоящего из 17 аминокислот, так и в виде биологически активного предшественника, содержащего 34 аминокислоты. Оба пептида определяются в одной и той же системе РИА .

б. На результаты РИА влияют биологически неактивные молекулярные фрагменты гормонов, такие, как C-концевой фрагмент ПТГ . Концентрация этого фрагмента в сыворотке в норме превышает концентрацию зрелого ПТГ ( ПТГ1—84 ), а при болезнях почек существенно увеличивается (даже у больных без вторичного гиперпаратиреоза). Поскольку для определения ПТГ обычно используют антитела к C-концевому фрагменту, правильная интерпретация результата требует оценки функции почек. Концентрацию ПТГ1—84 в плазме можно определить с помощью высокочувствительного иммунорадиометрического метода, основанного на использовании двух разных антител: к C- и N-концевому фрагментам ПТГ . Антитела к C-концевому фрагменту иммобилизируют на полимерном носителе. Затем добавляют пробы или стандарты (растворы ПТГ1—84 в сыворотке, предварительно очищенной от ПТГ и его фрагментов) и меченные 125 I антитела к N-концевому фрагменту ПТГ . Антитела, иммобилизированные на носителе, связывают как C-концевой фрагмент, так и ПТГ1—84 , но антитела к N-концевому фрагменту связываются только с ПТГ1—84 . Такой подход используют и в других случаях, когда в пробе присутствуют молекулярные фрагменты гормона.

в. У животных разных видов первичные структуры одного и того же пептидного гормона могут быть идентичными, но чаще различаются по одной или нескольким аминокислотам. Аминокислотные замены возникают в результате мутаций и, как правило, локализуются в участках молекулы гормона, не играющих первостепенной роли в его биологической активности. Различия в первичной структуре определяют иммунореактивность гормона.

2. Гетерогенность других соединений

а. Лекарственные средства и наркотики. Вещества, структурно сходные с препаратом, и его метаболиты могут связываться или не связываться с антителами. Если измеряют содержание токсичного препарата, то необходимо знать, выявляет ли данная методика только активную форму препарата. Напротив, если требуется доказать употребление наркотика, то различия в иммунореактивности между самим наркотиком и его метаболитами можно не учитывать. Таким образом, требования к специфичности РИА зависят от цели анализа.

б. Ферменты. РИА позволяет измерять содержание фермента, но не его активность. Ингибиторы и активаторы фермента и присутствие субстрата не влияют на результат. В одной и той же системе можно определять как сам фермент, так и профермент и другие неактивные формы фермента. В зависимости от задач исследования эти особенности метода могут играть положительную или отрицательную роль, поскольку многие ферменты обладают видовой специфичностью, а биологическая активность фермента необязательно коррелирует с его иммунохимической реактивностью. Поэтому РИА следует рассматривать как дополнение к методам анализа ферментов, основанным на определении их активности, а не как замену этих методов.

III. Чувствительность и специфичность РИА

А. Чувствительность РИА очень высока. Некоторые методики выявляют очень низкие концентрации веществ, такие, как 10 –14 моль/л. Чувствительность особенно важна при измерении базальных концентраций пептидных гормонов (эти концентрации обычно находятся в пределах от 10 –13 до 10 –10 моль/л), а также при определении гормонов непептидной природы, наркотиков и лекарственных средств, ферментов, бактериальных и вирусных антигенов.

Б. Специфичность РИА определяется специфичностью антител и может быть чрезвычайно высокой. Получены антитела и разработаны методики РИА , позволяющие дифференцировать антигены с малейшими структурными различиями, в том числе:

1. T3 и T4 (различаются одним атомом йода).

2. Кортизол и кортикостерон (различаются одним гидроксильным радикалом).

3. Инсулины человека и свиньи (различаются концевой аминокислотой B-цепи).

4. Инсулины свиньи, кашалота и собаки (имеют одинаковую последовательность аминокислот, но разную конформацию).

IV. Особенности применения РИА в клинике. В основе определения многих сотен эндогенных и экзогенных веществ лежит общий принцип, но требования к чувствительности метода и диагностическое значение результатов различаются.

А. Концентрации некоторых пептидных гормонов у одного человека меняются в очень широких пределах: под влиянием стимуляторов или ингибиторов секреции и в зависимости от времени суток уровень гормона может изменяться на 1—2 порядка. В таких случаях результаты РИА сами по себе не имеют первостепенного значения для диагноза. Пример: базальная концентрация гастрина в плазме у здоровых людей обычно В/в введение секретина вызывает выброс гастрина из опухоли, но не из нормальных клеток привратника. Напротив, пищевая нагрузка стимулирует секрецию гастрина в клетках привратника, но не в клетках гастриномы. Стимуляционные и супрессивные пробы могут потребоваться и в других подобных случаях.

Б. Концентрацию гормона следует сопоставлять с концентрациями веществ, метаболизм которых регулируется данным гормоном, и веществ, регулирующих его секрецию. Например, продукция инсулина усиливается при повышении концентрации глюкозы и некоторых аминокислот в крови и снижается при гипогликемии. Уровень СТГ возрастает при стрессе и гипогликемии и снижается при гипергликемии. Высокий уровень АКТГ в плазме на фоне сниженного уровня кортикостероидов свидетельствует о первичной надпочечниковой недостаточности; если же содержание кортикостероидов повышено, следует заподозрить гипофизарный синдром Кушинга. Для уточнения результатов РИА нередко требуются стимуляционные и супрессивные пробы.

В. При определении непептидных гормонов (в частности, стероидных и тиреоидных) чувствительность метода очень важна, поскольку в норме концентрации этих гормонов очень низкие.

Г. При определении концентраций лекарственных средств, особенно препаратов с узким терапевтическим диапазоном, также требуется высокая чувствительность РИА .

Д. При определении антигенов вирусов и микроорганизмов (таких, как антиген вируса гепатита B или туберкулопротеид) надо учитывать, что их абсолютная концентрация в какой-либо биологической жидкости зависит не только от тяжести инфекции, но и от других факторов, например — от способа получения материала.

Е. Биологическая активность гормона, его фрагмента или аналога далеко не всегда соответствует его иммунохимической реактивности. Чтобы по результатам РИА судить о биологической активности гормона, нужно знать, в каких молекулярных формах существует гормон и какие из них можно определить с помощью данной методики РИА . Например, гастрин присутствует в сыворотке в виде зрелого гормона, состоящего из 17 аминокислот (Г17), и в виде биологически активного предшественника, содержащего 34 аминокислоты (Г34). Поскольку Г17 метаболизируется значительно быстрее, чем Г34, в плазме преобладает Г34. Обе формы гастрина стимулируют секрецию соляной кислоты в желудке, причем относительная активность Г17 в 3—5 раз превышает активность Г34. После в/в введения собакам эквимолярных количеств Г17 и Г34 общий объем выделившейся кислоты одинаков, хотя уровень Г34 в плазме в 3—5 раз выше уровня Г17. Таким образом, результат определения биологической активности гастрина зависит от методики анализа.

V. Заключение. Роль РИА и других иммунохимических методов анализа в диагностике болезней и в фундаментальных медико-биологических исследованиях трудно переоценить. Тем не менее при планировании и оценке результатов иммунохимических исследований надо принимать во внимание все их особенности и тонкости и ставить диагностические задачи с учетом реальных возможностей метода.

1. Nussbaum SR, et al. Highly sensitive two-site immunoradiometric assay of parathyrin, and its clinical utility in evaluating patients with hypercalcemia. Clin Chem 33:1364, 1987.

2. Yalow RS. Radioimmunoassay. Annu Rev Biophys Bioeng 9:327, 1980.

3. Yalow RS. Heterogeneity of peptide hormones: Its relevance in clinical radioimmunoassay. Adv Clin Chem 20:1, 1978.

4. Yalow RS. Heterogeneity of peptide hormones. Recent Prog Horm Res 30:597, 1974.

5. Yalow RS. Radioimmunoassay: Practices and pitfalls. Circ Res 32, 33(Suppl 1):1, 1973.

6. Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J Clin Invest 39:1157, 1960.

Главная

Радиоиммунологический анализ. Принцип метода

Характерной чертой радиоиммунологических методов является сочетание специфичности, свойственной реакциям антиген-антитело, с простотой и высокой чувствительностью определения, которые дает применение радиоактивных изотопов, введенных в состав антигенов или антител. По сравнению с обычными методами анализа преимущество радиоиммунологического анализа состоит в том, что отсутствует необходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов. Важнейшим условием использования радиоиммунологического анализа является возможность соединения измеряемой радиоактивной субстанции с компонентами реакции антиген-антитело, как, впрочем, и наличие специфических сывороток и высокоочищенных антигенов. Получение высокотитражных сывороток к большинству белковых гормонов не представляет особых сложностей. Вещества, являющиеся гаптенами, например стероиды, медикаменты и продукты их метаболизма, простагландины, циклические нуклеозидмонофосфаты, можно легко перевести в иммуногенное состояние. Антигены и антитела весьма удобны для прямого и непрямого введения радиоактивной метки. Необходимая для исследований специфическая радиоактивность метки должна рассчитываться исходя из заданной чувствительности. Радиоактивность антигенов, применяемых в радиоиммунологическом анализе, обычно составляет 100—200 мкКи/мкг, радиоактивность антител — 20 мкКи/мкг, а для модификации радиоиммунологического анализа с двойными антителами — 0,1 мкКи/мкг. Возможность проводить конкурентный анализ, а также анализ в жидкой или твердой фазе приводит к созданию большого числа различных методик. Мы рассмотрим эту проблему на четырех характерных примерах.

Реакция антигенов с антителами приводит с течением времени к состоянию равновесия между свободным и связанным антигенов. Характерным для радиоиммунологического анализа является то обстоятельство, что меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания. После инкубации в пределах определенной области концентраций антигенов, количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена обратно пропорционально количеству немеченого антигена в пробе. Основные реакции представлены на следующей схеме:

I — специфическое антитело, II — меченый антиген, III — немеченый антиген (стандарт или образец),
IV — иммунные комплексы, состоящие из антител и меченого антигена, V — свободный меченый антиген,
VI — иммунные комплексы, состоящие из антител и немеченого антигена, VIII — свободный немеченый антиген

Для того чтобы происходило конкурентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. Теоретически радиоиммунологический анализ можно проводить как вариант сатурационного анализа. В этом специальном случае связывающий компонент Q представлен специфическим антителами, метка вводится в составе антигена. Детально теоретические аспекты рассматриваются в работе Walker и Кеапе. Кроме того, определенный интерес представляют вопросы, касающиеся различий связывания меченых и немеченых антигенов, влияния температуры, авидности и концентрации компонентов реакции. Для оценки качества АС необходимо знание константы авидности К. Ее можно определить по методу Скэтчарда и Михаэлиса — Ментен. Отклонения от идеальной формы кривой можно рассматривать как выражение гетерогенности реакции связывания, которая обусловлена негомогенностью популяции антител. Наиболее удачные концентрации антител оказываются равными 3/К меченого антигена 4/К. Между чувствительностью метода (S) и авидностью существует соотношение:

Заключение о степени конкуренции между меченым антигенами и А Г исследуемой пробы можно сделать только после отделения образовавшихся ИК от несвязанного меченого антигена. Для отделения ИК используют самые разнообразные методы, основанные на различиях в растворимости, коэффициенте седиментации, заряде, молекулярной массе и др. В некоторых случаях на способ выделения ИК оказывают влияние специфические свойства исследуемого антигена. Для того чтобы разделение меченого несвязавшегося антигена и ИК было удовлетворительным, необходимо соблюдение трех условий:
1) процесс разделения не должен оказывать влияния на состояние равновесия;
2) отделение связанных с антителами молекул от несвязанных должно носить количественный характер;
3) затрата рабочего времени и стоимость процесса должны быть незначительными.

Известно много способов достижения вышеперечисленных условий. Различия в заряде и относительной молекулярной массе позволяют проводить разделение при помощи электрофореза или гель-хроматографии. В некоторых случаях возможна селективная адсорбция антигена на тонко измельченном тальке, кварце, декстране или целлюлозе, соединенных с активированным углем. Связанные антигены можно улавливать при помощи иммобилизованных антител, например полимеризованных антител, или осаждением ИК специфической АС. Конъюгация антител с железосодержащими частицами энзакрила позволяет проводить разделение в магнитном поле. Различные способы разделения антигенов и ИК требуют неодинаковых затрат времени, их воспроизводимость также неодинакова. То же самое относится к возможности автоматизации отдельных этапов анализа. Наибольшее внимание привлекают к себе в настоящее время методы, основанные на использовании двойных антител.

Читайте также:  Анализ на иммуноглобулин

Известным упрощением метода является использование связанных с целлюлозой вторичных АС, так называемая технология двойных антител на твердой фазе. Оптимальное для радиоиммунологического анализа разведение АС устанавливается по 50% связыванию меченого антигена. АС в данном разведении в присутствии меченого антигена смешивается с возрастающим количеством немеченого антигена. Зависимость связывания меченого антигена от концентрации стандартного антигена можно представить в виде различных графиков. Часто используют график зависимости процента связывания меченого антигена от концентрации немеченого. Уже упоминавшиеся во введении Берсон и Ялоу предложили использовать соотношение связанного меченого антигена к несвязанному в качестве оценки концентрации немеченого антигена.

При использовании арифметических координат получается экспоненциальная кривая, полулогарифмических — кривая с прямолинейным участком, логарифмических — кривая с увеличенным прямолинейным участком. Особый интерес представляет возможность конкурентного взаимодействия с чужеродными веществами, например медикаментами. Специфичность метода оценивают также по перекрестной реактивности с применяемыми сыворотками; заключение в этом случае выносится на основании определения меченого антигена в присутствии сопутствующего антигена. Ошибки, связанные с вышеперечисленными модификациями, можно устранить, используя дополнительную очистку реагентов, что, однако, увеличивает стоимость исследования. Все чаще начинают применять моноклональные антитела для радиоиммунологического анализа. Уже описаны радиоиммунологические способы определения морфина и человеческого лейкоцитарного интерферона с использованием моноклональных или полученных аффинной очисткой антител. В случае конкурентного анализа белкового связывания вместо антисывороток используют транспортные белки. Следует учитывать, что специфичность их связывания и авидность не всегда, удовлетворительны.

Твердофазный радиоиммунологический анализ

Впервые в качестве водонерастворимого носителя для белков была применена пара-аминобензилцеллюлоза. В последующее время было описано большое количество твердых носителей, нашедших применение в секвенировании, синтезе и других манипуляциях с белками. Эти носители, соединяясь с антигеном или антителом, не изменяют их иммунологические свойства.

Полимеры, например сефадекс и сефароза, после их обработки бромцианом приобретают способность связывать белки. В дальнейшем была установлена способность многих полимеров (полиэтилен, полипропилен, полистирол), называемых обычно матрицами, связывать различные биологические макромолекулы без всякой предварительной химической обработки. Оказалось, что полимеры обладают способностью связывать антитела, которые можно использовать для определения различных гормонов (хорионического гонадотропина, лютеотропного гормона, тиреостимулирующего гормона, гормона роста и др.) методом радиоиммунологического анализа. Связанный с твердой фазой комплекс антиген-антитело легко отделяется от несвязавшегося биологического материала, кроме того, он обладает высокой стабильностью. Меченый антиген, необратимо связываясь с фиксированными на матрице антитела, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологического материала. Антитела можно присоединять к активированной или неактивированной матрице. Основной проблемой будет в обоих случаях точное дозирование связавшихся с матрицей антитела.

Связывание антител с матрицей. Нефракционированные АС кроликов с известным титром нейтрализации бактериофагов ТЗ и Т4 разводили 0,1 М карбонат-бикарбонатным буфером с рН 9,6. Сыворотки в различных разведениях вносили в пластиковые пробирки по 0,5 мл. Пробирки закрывали и выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре, затем удаляли жидкую фазу. Легко десорбирующиеся антитела удаляли двукратным ополаскиванием в 0,14 М NaCl (по 1 мл). Затем проводили инкубацию с 0,01 М калий-фосфатным буфером с рН 7,4, содержащим 0,14 М NaCl и 0,5% ЧСА, для насыщения свободных участков пластиковой поверхности нейтральным белком. Пластиковые пробирки с адсорбированными антителами можно использовать немедленно или хранить в холодильнике в течение 4 недель.

Мечение антигена. Бактериофаги ТЗ и Т4 после маркирования их 131 [I] или 125 [I] сохраняют полностью иммунологическую реактивность. Иодирование проводили Т-хлораминовым методом. Специфическая радиоактивность фагов составляла 0,3—7,2 мкКи/мкг. В целом более высокая специфическая радиоактивность повышает чувствительность анализа. После удаления радиоактивного йода гель-фильтрацией через сефадекс и диализа препарат радиоактивных фагов разводят калий-фосфатным буфером с рН 7,4 (см. выше) для предотвращения радиолиза.

Оптимизация анализа. Вначале определяют оптимальное разведение антител и меченого фага для достижения максимального связывания материала с твердой фазой. Исследовалась также зависимость этих процессов от времени. На рисунке представлены данные, относящиеся к фагу Т3, меченному 131 I.

Зависимость связывания меченых фагов ТЗ с антителами, адсорбированными на пластиковой поверхности от времени инкубации, разведения сыворотки, титра антисыворотки, концентрации меченого свидетеля. Пластиковые пробирки обрабатывали двумя антисыворотками к фагу ТЗ с различными титрами нейтрализации. Антисыворотка 7: К=150, антисыворотка 8: К=370

1 — антисыворотка 8,1 : 100, 0,05 мкКи метки; 2 — антисыворотка 8,1 : 1000, 0,05 мкКи метки;
3 — антисыворотка 7,1 : 1000, 0,025 мкКи метки; 4 — антясыворотка 8,1 : 1000, 0,025 мкКи меткн.

Аналогичные данные были получены для фага Т4. Соотношение связанный/несвязанный (с/н) меченый фаг отражает воздействие различных факторов. Наилучшие результаты были получены при разведении сыворотки 1:500 или 1: 1000 и при концентрации меченого материала 0,0125 мкКи (около 16000 имп/мин; расчет ведется на 1 пластиковую пробирку). Зависимость от времени исследовали в течение 48-часовой инкубации при температуре 37 °С. Вначале наблюдается быстрое увеличение количества связанной метки, к 12 ч инкубации оно заметно снижается, а затем выходит на плато.

Тест-системы радиоиммунологического анализа на фаги ТЗ и Т4. Пробирки, обработанные специфической АС в разведении 1 : 1000, инкубировали с неизвестным количеством антигенов, растворенного в 0,5 мл калий-фосфатного буфера с рН 7,4 в течение 18 часов при 37°С. После удаления образца с фагом и двукратного отмывания охлажденным до О°С 0,14 М NaCl в каждую пробирку вносят по 0,0125 мкКи меченого антигена, растворенного в 0,5 мл буфера (см. выше). Заключительная инкубация продолжается 24 часа; если ее продолжительность сократить до 22 часов, то это несколько снизит чувствительность анализа. Количество связавшегося меченого антигена определяют после отмывки пробирок раствором NaCl. Измерение радиоактивности проводят на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Эффективность счета 125 [I] составляла 54%. Получаемая зависимость носит характер, представленный на рисунках.

Стандартная кривая для фага ТЗ

Пластиковые пробирки обрабатывали антисывороткой 1 : 1000.
Количество метки — 0,025 мкКи на пробирку. Специфическая активность 2,3 мкКи/мкг.
1 — внесение меченого свидетеля после удаления неактивного антигена;
2 — совместное введение меченого и немеченого антигенов.

Стандартная кривая для фага Т4

Пластиковые пробирки обрабатывали антисывороткой 1 : 1000.
Количество метки — 0,025 мкКи на пробирку. Специфическая активность 7,2 мкКи/мкг.
1 — меченый свидетель и немеченый антиген внесены одновременно;
2 — меченый свидетель внесён после удаления немеченого антигена.

Линейная зависимость наблюдалась в области концентраций немеченого антигена от 18 до 1800 нг для фага Т3 и от 46 до 4600 нг для фага Т4.

Метод двойных антител

Определяли IgE в крови нормальных и страдающих аллергией пациентов при помощи вторичной преципитирующей АС. В качестве первичного связывающего агента использовали моноспецифическую кроличью антисыворотку к Fc-фрагменту IgE. Чистый IgE получали из плазмы пациента, страдающего IgE продуцирующей миеломой. Специфическая активность меченого антигена составляла 150—250 мкКи/мкг. Все разведения готовили на 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,5) с добавлением 1% БСА.

Определение IgE в сыворотке человека. Стандарт IgE или анализируемую сыворотку доводят БСА-фосфатным буфером до объема 0,5 мл. Специфическую кроличью анти-IgE сыворотку в разведении 1:50 000 вносят аликвотами по 0,1 мл в измерительные сосуды. В таком же объеме вносят 0,1 нг меченого антигена. После инкубации (24—96 ч при 4°С) добавляют 0,15 мл козьей АС к IgG кролика и 0,15 мл разведенной в соотношении 1:20 нормальной сыворотки кролика. Наличие нормальной сыворотки облегчает преципитацию в зоне эквивалентности на последней стадии инкубации. Этот этап занимает 18—72 ч при 4 °С. Надосадочную фракцию после 30-минутного центрифугирования при 3500 g отбрасывают. Процент адсорбированной радиоактивности используется для построения стандартной кривой. В описанных условиях можно определять 1—14 нг IgE. Добавление иммуноглобулин других классов (2 мг IgA, 0,5 мг IgM, 4 мг IgG) вызывало снижение включения метки всего лишь на 6%.

Стандартная кривая для определения IgE методом двойных антител

Радиоиммунологический анализ.

Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода ( 125 I или 131 I). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков- или-излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопасность работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.

Однако там, где в качестве АГ выступает низкомолекулярный гаптен (например, лекарственные препараты, стероидные и пептидные гормоны и др.) РИА используется весьма широко. Существуют его гетерогенные варианты, аналогичные ИФА, а также конкурентные варианты.

В последнем случае на твердую фазу (например, полистироловые шарики) сорбируют известные АТ в комплексе с радиоактивно меченым АГ (например, лекарственным препаратом) в известной концентрации. К этому комплексу добавляют исследуемый материал, содержащий неизвестную концентрацию изучаемого лекарственного препарата-АГ. Он вытесняет из комплекса меченый АГ пропорционально своей концентрации. Радиоактивность вытесненного АГ измеряют с помощью счетчика и определяют концентрацию неизвестного АГ.

Клеточные методы оценки иммунитета

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Переход малых лимфоцитов в бластные формы, способные к пролиферации и дальнейшей дифференцировке называется бласттрансформацией и сопровождается морфологическими изменениями лимфоцитов. Бласты – крупные, округлой формы клетки имеют большое ядро, занимающее большую часть цитоплазмы. В ядре содержится несколько крупных базофильных ядрышек, цитоплазма бластов зернистая. Одна бластная клетка может дать клон из 16-32 и даже 64 клеток, обладающих более высокой иммунокомпетентностью, чем исходный лимфоцит. Бласттрансформация лимфоцитов может быть вызвана специфическими антигенами и неспецифическими стимуляторами (митогенами). К бактериальным митогенам относятся полисахариды грамотрицательных бактерий, туберкулин микобактерий и др.

Способностью вызывать бласттрансформацию лимфоцитов обладают отдельные продукты животного (иммуноглобулин, выделенный из гетерологичной иммунной сыворотки) и растительного (фитогемагглютинин – ФГА) происхождения.

При постановке РБТЛ кровь или выделенные из нее лейкоциты вносят в среду RPMIили Игла, затем добавляют антиген или митоген. Учет реакции после внесения митогенов проводят через 2-4 суток, а после стимуляции антигенами через 3-5 суток. Неспецифический митоген ФГА трансформирует в бласты 30-50%, а ЛПС – до 30% лимфоцитов крови человека. Под влиянием специфических антигенов в бласты трансформируются не более 5-10% малых лимфоцитов.

Результаты РБТЛ можно учитывать морфологически – прямым подсчетом бластов на окрашенных препаратах под микроскопом или радиометрическим методом, измеряя уровень включения в ДНК лимфоцитов тимидина, меченного тритием.

Реакция подавления миграции лейкоцитов (РПМЛ).

Сущность ее в том, что в присутствии антигенов лимфоциты выделяют цитокины (лимфокины), в частности, фактор, подавляющий миграцию нейтрофилов и макрофагов. К взвеси лейкоцитов добавляют антиген и заполняют ею капиллярные трубочки (контроль – без антигена или посторонний антиген). Эти капилляры помещают в камеры или лунки, заполненные питательной средой. После инкубации при 37 0 С 18 часов измеряют зону миграции клеток из капилляров или подсчитывают их количество в лунке. Если есть иммунные клетки (т.е. организм сенсибилизирован к антигену), то миграция лейкоцитов подавляется.

Кожные пробы и другие провокационные тесты

Для определения гиперчувствительности (аллергии) к антигенам-аллергенам у людей проводят провокационные тесты.Суть их в том, что соответствующий аллерген вводят в организм перорально, ингаляционно, наносят на кожу при ее скарификации или вводят внутрикожно. Обычно, спустя 30 минут оценивают немедленные аллергические реакции (ПЧНТ), а через 24-48 час – замедленные (ПЧЗТ).

На пыльцевые, пищевые, лекарственные аллергены чаще наблюдаются немедленные кожные реакции в виде покраснения и припухлости. Замедленные реакции развиваются на бактериальные антигены. Пробу Манту ставят для выявления сенсибилизации к микобактериям туберкулеза (оценка вакцинации и инфицированности). Туберкулин РРDвводят внутрикожно и при положительной реакции через 24-48 час в месте инъекции возникает воспалительная реакция. Она указывает на наличие сенсибилизации к этому антигену. Сильная реакция, или, наоборот, ее отсутствие (анергия) может быть при туберкулезе.

Кожные пробы могут использоваться для выявления иммунодефицитов и оценки резистентности к конкретной инфекции. Большинство людей встречались в течение жизни с антигенами распространенных условно-патогенных бактерий и в норме имеют к ним сенсибилизацию. При постановке внутрикожных проб с аллергенами стафилококка, стрептококка, кишечной палочки, протея, микобактерий туберкулеза (туберкулин) и другими, реакция должна быть положительной хотя бы на один из них. Отсутствие реакции может указывать на иммунодефицит.

Читайте также:  Генетический анализ при беременности

Радиоиммунный анализ: принципы, вид, основные этапы исследования, приборы. Применение в КДЛ

Радиоиммунный анализ (РИА), также радиоиммунологический или изотопный иммунологический анализ, (англ. Radioimmunoassay, RIA) — метод количественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами (чаще всего с АТ), с последующей детекцией на специальных счетчиках — радиоспектрометрах.

Впервые метод был разработан Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу в 1950-х годах. С помощью этого метода они изучали клиренс инсулина у больных диабетом. Р. Ялоу получила за это Нобелевскую премию в 1977 году.

Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп йода 125 I , который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность.

В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для Р. а. выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

Радиоиммунный анализ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Так, например, с помощью коммерческого набора фирмы “ЭББОТТ” — Австрия II-I 125 удается выявлять HBsAg в концентрациях до 0,1 нг/мл. К преимуществам метода можно отнести возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Диагностические наборы для выявления различных антигенов вирусов гепатитов А, В и D и антител к ним выпускаются фирмой “Изотоп” (Ташкент) и некоторыми зарубежными фирмами (например, фирмой “ЭББОТТ”). В качестве твердой фазы применяются полистироловые шарики (“ЭББОТТ”) или пробирки (“Изотоп”). Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп I 125 , который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Измерение радиоактивной метки, т. е. излучения, проводится на специальных счетчиках — радиоспектрометрах. Подсчет радиоактивных импульсов как в контрольных, так и исследуемых образцах проводится в единое фиксированное время, обычно в течение 1 минуты. При анализе результатов реакции необходимо учитывать наличие фона радиоактивности, который может влиять на конечный результат реакции. Причинами повышенного фона могут быть: загрязнение контейнера или гнезда для пробы; неправильная настройка прибора; наличие источника сильного излучения вблизи прибора.

Для подтверждения положительного результата, полученного при первичном скрининге образцов, рекомендуется повторное исследование РИА или в альтернативном тесте. При обнаружении HBsAg необходимо проводить конфирмационный тест.

Радиоиммунный анализ – высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело, один из компонентов которой несет радиоактивную метку. Метод позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе.

Метод применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов.

Хроматография: теоретические основы, принцип метода. Сорбенты и элюенты для хроматографического анализа. Методы проявления хроматограмм. Основные виды хроматографии: адсорбционная, ионообменная, гель-фильтрация, аффинная, ВЭЖХ. Аналитические характеристики, применение в клинике.

Хроматография (от греч. χρώμα — цвет) — метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Основан на распределении веществ между двумя фазами — неподвижной (твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе, сорбент) и подвижной (газовая или жидкая фаза, элюент). Название метода связано с первыми экспериментами по хроматографии, в ходе которых разработчик метода Михаил Цвет разделял ярко окрашенные растительные пигменты. Хроматограмма — результат регистрирования зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени.

Основные виды хроматографии. В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают следующие основные виды — адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную (молекулярно-ситовую) и осадочную.

Адсорбционнаяхроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью); распределительнаяхроматография — на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесённая на твёрдый макропористый носитель) и элюенте (следует иметь в виду, что при распределительном механизме разделения на перемещение зон компонентов частичное влияние оказывает и адсорбционное взаимодействие анализируемых компонентов с твёрдым сорбентом); ионообменнаяхроматография — на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси; эксклюзионная (молекулярно-ситовая)хроматография — на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Эксклюзионная хроматография подразделяется на гель-проникающую (ГПХ), в которой элюент — неводный растворитель, и гель-фильтрацию, где элюент — вода. Осадочная Х, основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой неподвижной фазе.

В соответствии с агрегатным состоянием элюента различают газовую и жидкостную Х. В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы газовая Хбывает газо-адсорбционной (неподвижная фаза — твёрдый адсорбент) и газожидкостной (неподвижная фаза — жидкость), а жидкостная Х — жидкостно-адсорбционной (или твёрдо-жидкостной) и жидкостно-жидкостной. Последняя, как и газо-жидкостная, является распределительной Х. К твёрдо-жидкостной Х относятся тонкослойная и бумажная.

Различают колоночную и плоскостную Х. В колоночной сорбентом заполняют специальные трубки — колонки, а подвижная фаза движется внутри колонки благодаря перепаду давления. Разновидность колоночной Х — капиллярная, когда тонкий слой сорбента наносится на внутренние стенки капиллярной трубки. Плоскостная Х подразделяется на тонкослойную и бумажную. В тонкослойной Х тонкий слой гранулированного сорбента или пористая плёнка наносится на стеклянную или металлическую пластинки; в случае бумажной Х используют специальную хроматографическую бумагу. В плоскостной Х перемещение подвижной фазы происходит благодаря капиллярным силам.

При хроматографировании возможно изменение по заданной программе температуры, состава элюента, скорости его протекания и др. параметров.

В зависимости от способа перемещения разделяемой смеси вдоль слоя сорбента различают следующие варианты Х: фронтальный, проявительный и вытеснительный. При фронтальном варианте в слой сорбента непрерывно вводится разделяемая смесь, состоящая из газа-носителя и разделяемых компонентов, например 1, 2, 3, 4, которая сама является подвижной фазой. Через некоторое время после начала процесса наименее сорбируемый компонент (например, 1) опережает остальные и выходит в виде зоны чистого вещества раньше всех, а за ним в порядке сорбируемости последовательно располагаются зоны смесей компонентов: 1 + 2, 1 + 2 + 3, 1 + 2 + 3 + 4. При проявительном варианте через слой сорбента непрерывно проходит поток элюента и периодически в слой сорбента вводится разделяемая смесь веществ. Через определённое время происходит деление исходной смеси на чистые вещества, располагающиеся отдельными зонами на сорбенте, между которыми находятся зоны элюента. При вытеснительном варианте в сорбент вводится разделяемая смесь, а затем поток газа-носителя, содержащего вытеснитель (элюент), при движении которого смесь через некоторый период времени разделится на зоны чистых веществ, между которыми окажутся зоны их смеси . Ряд видов Х осуществляется с помощью приборов, называемых хроматографами, в большинстве из которых реализуется проявительный вариант Х.Хроматографы используют для анализа и для препаративного (в т. ч. промышленного) разделения смесей веществ. При анализе разделённые в колонке хроматографа вещества вместе с элюентом попадают через различные промежутки времени в установленное на выходе из хроматографической колонки детектирующее устройство, регистрирующее их концентрации во времени. Полученную в результате этого выходную кривую называют хроматограммой. Для качественного хроматографического анализа определяют время от момента ввода пробы до выхода каждого компонента из колонки при данной температуре и при использовании определённого элюента. Для количественного анализа определяют высоты или площади хроматографических пиков с учётом коэффициентов чувствительности используемого детектирующего устройства к анализируемым веществам.

Для анализа и разделения веществ, переходящих без разложения в парообразное состояние, наибольшее применение получила газоваяхроматография, где в качестве элюента (газа-носителя) используются гелий, азот, аргон и др. газы. Для газо-адсорбционного варианта Х в качестве сорбента (частицы диаметром 0,1—0,5 мм)используют силикагели, алюмогели, молекулярные сита, пористые полимеры и др. сорбенты с удельной поверхностью 5—500 м 2 /г. Для газо-жидкостной Х сорбент готовят нанесением жидкости в виде плёнки (высококипящие углеводороды, сложные эфиры, силоксаны и др.) толщиной несколько мкм на твёрдый носитель с удельной поверхностью 0,5—5 м 2 /г и более. Рабочие температурные пределы для газо-адсорбционного варианта Х от —70 до 600 °С, для газо-жидкостного от —20 до 400 °С. Газовой Х можно разделить несколько см 3 газа или мг жидких (твёрдых) веществ; время анализа от несколькихсек до нескольких часов.

В жидкостной колоночнойХ в качестве элюента применяют легколетучие растворители (например, углеводороды, эфиры, спирты), а в качестве неподвижной фазы — силикагели (в т. ч. силикагели с химически привитыми к поверхности различными функциональными группами — эфирными, спиртовыми и др.), алюмогели, пористые стекла; размер частиц всех этих сорбентов несколько мкм. Подавая элюент под давлением до 50 Мн/м 2 (500 кгс/см 2 ), удаётся сократить время анализа от 2—3 ч до нескольких мин. Для повышения эффективности разделения сложных смесей используют программируемое во времени изменение свойств элюента путём смешения растворителей разной полярности (градиентное элюирование).

В тонкослойной и бумажной Х исследуемую смесь в жидком виде наносят на стартовую линию (начало пластинки или полоски бумаги), а затем разделяют на компоненты восходящим или нисходящим потоком элюента. Последующее обнаружение (проявление) разделённых веществ на хроматограмме (так в этих случаях называют пластину с нанесённым на неё сорбентом или хроматографическую бумагу, на которых произошло разделение исследуемой смеси на компоненты) осуществляют при помощи ультрафиолетовой (УФ) спектроскопии, инфракрасной (ИК) спектроскопии или обработкой реактивами, образующими с анализируемыми веществами окрашенные соединения.

Качественно состав смесей с помощью этих видов Х характеризуют определённой скоростью перемещения пятен веществ относительно скорости движения растворителя в данных условиях. Количественный анализ осуществляют измерением интенсивности окраски вещества на хроматограмме.

Хроматография широко применяется в лабораториях и в промышленности для качественного и количественного анализа многокомпонентных систем, контроля производства, особенно в связи с автоматизацией многих процессов, а также для препаративного (в т. ч. промышленного) выделения индивидуальных веществ (например, благородных металлов), разделения редких и рассеянных элементов.
Газовая Хроматография применяется для газов разделения, определения примесей вредных веществ в воздухе, воде, почве, промышленных продуктах; определения состава продуктов основного органического и нефтехимического синтеза, выхлопных газов, лекарственных препаратов, а также в криминалистике и т.д. Разработаны аппаратура и методики анализа газов в космических кораблях, анализа атмосферы Марса, идентификации органических веществ в лунных породах и т.п.
Газовая Хроматография применяется также для определения физико-химических характеристик индивидуальных соединений: теплоты адсорбции и растворения, энтальпии, энтропии, констант равновесия и комплексообразования; для твёрдых веществ этот метод позволяет измерить удельную поверхность, пористость, каталитическую активность.
Жидкостная Хроматография используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и др. биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10 -11 —10 -9 г ), что исключительно важно в биологических исследованиях. Часто применяется молекулярно-ситовая Хроматография и Хроматография по сродству; последняя основана на способности молекул биологических веществ избирательно связываться друг с другом.
Тонкослойная и бумажная Хроматография используются для анализа жиров, углеводов, белков и др. природных веществ и неорганических соединений.
В некоторых случаях для идентификации веществ используется Хроматография в сочетании с др. физико-химическими и физическими методами, например с масс-спектрометрией, ИК-, УФ-спектроскопией и др. Для расшифровки хроматограмм и выбора условий опыта применяют ЭВМ.

Дата добавления: 2015-04-19 ; просмотров: 6034 . Нарушение авторских прав

Добавить комментарий